重組蛋白簡單的說就是是人工合成蛋白。在知道編碼該蛋白的基因序列之后,人工克隆該基因進入質粒。然后再把質粒轉染如大腸桿菌。這樣大腸桿菌就成了蛋白表達的工廠。表達出來的蛋白再進過分離純化,就是重組蛋白。目前重組蛋白在制藥工業上主要是指表達獲得的細胞因子、凝血因子或者人工設計的蛋白分子。

研究重組蛋白的作用時要先做體外實驗,再做體內實驗。知道大致是哪方面的功能,否則就是瞎撞了。可以從重組前的蛋白的功能中尋找方向,如果什么都不知道就在細胞中加點重組蛋白,先做個MTT看看細胞死活,確定有沒有功能


以大腸桿菌為例介紹一下重組蛋白質的提取步驟。

(1) 大腸桿菌的酶解:

1) 4℃ 、1000g離心15 min收集細菌細胞,倒去上清液,將濕細菌稱重。

2) 每克細菌細胞中加入約3 ml溶菌酶緩沖液(50mmol/L Tris·HCl,pH 8. 0;lmmol/L EDTA;50mmo1/L NaCl; lmmol/L PMSF),渦旋,使菌體完全懸浮,加入溶菌酶,終濃度至0. 3mg/ml,于4℃攪拌30min。

3)攪拌下加入脫氧膽酸鹽,終濃度至1 mg/ml。

4)加入核酸酶,終濃度至10mg/ml,攪拌下室溫作用15 min。

5) 4℃、10000g離心15 min,分別收集上清液和沉淀,進行SDS-PAGE,確定目標蛋白質存在于哪個組分中,如果目標蛋白質位于沉淀中,則重組蛋白是以包涵體的形式存在。

(2)包涵體的清洗:

1) 將破菌后的沉淀重懸于適當的緩沖液中,渦旋混合5 min,離心收集沉淀。

2)將上述沉淀重懸于1%的Triton X-100中,渦旋混合5 min,離心收集沉淀。

3) 將上述沉淀重懸于4mol/L的尿素或鹽酸肌中,渦旋混合5 min,離心收集沉淀。

4)將破菌后的沉淀重懸于適當的緩沖液中,渦旋混合5 min,離心收集沉淀。

根據清洗的情況,可以適當地增加2)、3)步的洗滌次數。

(3) 從包涵體中溶解重組蛋白:在溶解包涵體時,可以選用2%的SDS、8mol/L的尿素或8mol/L的鹽酸肌等裂解液,根據蛋白質的特性、實驗的要求進行選擇,并進行優化。下面以8 mol/L鹽酸肌為例,溶解包涵體中的重組蛋白質。

1)用裂解液(50mmo1/L Tris·HCl, pH 8.0, 8mo1/L鹽酸胍,1mmol/L DTT)重懸清洗后的包涵體,如果重懸困難,可適當地進行超聲處理,然后在室溫下作用lh,并不時地渦旋混合。

2) 4℃、20000g離心30min,除去不溶性物質,保留上清。

提取方法:

一.固液萃取
在固液萃取中,提取物是由固相轉為液相,或由細胞內轉為細胞外,其提取效率與物質的擴散作用有關。
為了增加擴散物質的量,也就是提高提取速度,常采用如下措施:
1)提高材料的破碎程度,以增加擴散面積,減少擴散距離;
2)進行攪拌,使已擴散的溶質迅速與溶劑混勻,以保持兩項界面最大濃度差,或分多次提取,不斷更換新鮮溶劑,以提高擴散速率;
3)延長提取時間,提高提取溫度,以及減少溶液粘度(如屬大分子核酸干擾,加入少量魚精蛋白或硫酸鏈霉素沉淀除去)等。
實際上從破碎后的固體細胞提取所需組分,當細胞破碎程度及提取溫度受到限制時,采用少量多次提取方法較為有利。
二.液液萃取
液液萃取選用的溶劑必須與被抽提的溶液互不混合、且對被抽提的溶質有選擇性的溶解能力。最常用的液液萃取溶劑為二相溶劑,水或水-醇為一相,與水互不相溶的各種碳氫化合物,如低級醚、酯、苯酚等,為另外一相。  


提取一些具有生理活性的物質時,除了考慮被提取物溶解度外,還應考慮被提取物活性的保護。對于一些生物大分子如蛋白質、酶和核酸來說,主要措施有如下幾點;
1.采用緩沖系統 防止提取過程中某些酸堿基團的解離,造成溶液中PH值變化幅度過大,導致某些活性物質的變性、或由于PH變化影響提取的效果。在生化制備中,提取中常用的緩沖系統有磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、Tris緩沖液、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液等。
[緩沖液] 分為非-雙性離子緩沖化合物類和雙性離子緩沖化合物類。前者包括HCl-KCl、甘氨酸-HCl、烏頭酸鹽-NaOH、檸檬酸鹽-磷酸鹽、檸檬酸鹽-NAOH、醋酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽-NAOH、磷酸鹽、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸鹽-碳酸氫鹽等,存在反應性和緩沖能力有限等缺點。雙性離子緩沖液雖然具有很多優點,但依然存在反應性與不適應性的問題,如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性(反應性)、不適應于所有的組織培養(不適應性)。
2.加入保護劑 防止某些生物活性物質的活性基團及酶的活性中心受到破壞。如最常見的巰基,是許多活性物質和酶催化的活性基團,極易被氧化,故提取時常加入一些還原劑。一些易受重金屬離子抑制生理活性的物質,加入某些金屬螯合劑,把有害金屬離子螯和掉,而保持被提取物的活性。 [螯合劑和巰基試劑] 巰基試劑在生化反應中有兩個用途,一是防止蛋白質或酶等分子中的SH-基氧化成S-S,二是某些酶反應中維持體系的還原環境。經常應用的巰基試劑有二硫丁醇類化合物(如二硫蘇糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE)和2-巰基乙醇,谷胱甘肽也經常應用。一般來說二硫丁醇類是常選用的巰基試劑,不僅是因為揮發性低,難聞的氣味較少,而且氧化電位低,比2-巰基乙醇濃度低很多的情況下,可以使其他二硫化合物完全還原。螯合劑用于控制反應中金屬離子濃度或去除金屬離子,常用的螯合劑有EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA、1,10-二氮雜菲、檸檬酸和磷酸等。
3.抑制水解酶的破壞 根據不同水解酶的性質采用不同方法。如需要金屬離子激活的水解酶,常加入EDTA或用檸檬酸緩沖液除去溶液中的某些金屬離子,使酶的活性受到抑制;對熱不穩定的水解酶,可以用熱提取法使之失去作用;或選用PH范圍,使酶活性最低;還可針對性地加入某些抑制劑,以抑制水解酶的活性,但此類方法在蛋白提取中應用較少。
4.其它一些特殊要求的保護措施 除避免紫外線、強烈攪拌、過酸過堿、高溫、凍結等情況外,有些蛋白質在提取時還有特殊要求,如固氮酶鉬-鐵蛋白,必須在無氧條件下進行。  

重組蛋白的分離純化有:1、沉淀分離技術(鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、變性沉淀法) 2、液液萃取技術 3、層析法(離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析)

重組蛋白分離純化技術近幾年發展迅速,今后重組蛋白的分離純化技術的發展將圍繞著快速、高分辨率。高上樣量、易于操作、低成本和電腦控制的全自動化等技術面展開。希望今后能有更多更好的方法來提純蛋白吧~