蛋白的酵母雙雜交實驗——以釣餌蛋白篩選 cDNA 文庫研究蛋白相互作用

第一部分 系統簡介

1. 實驗原理

蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎,研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的實驗。很早就已知道,轉錄活化蛋白可以和 DNA 上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄反應。這種 DNA 結合與轉錄激活的功能是由轉錄活化蛋白上兩個相互獨立的結構域即 DNA 結合結構域(Binding Domain, BD)和轉錄活化結構域(Activation Domain, AD)分別來完成的,并且這兩個結構域對于基因的轉錄活化都是必須的。目前酵母雙雜交實驗采用的系統有 LexA 系統 Gal4 系統兩種。在 LexA 系統中,DNA 結合結構域由一個完整的原核蛋白 LexA 構成,轉錄活化結構域則由一個 88 個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽 B42 構成,它在酵母中可以活化基因的轉錄 Gal4 系統中,BD  AD 分別由 Gal4 蛋白上不同的兩個結構域(1-147aa  768-881aa)構成。在利用GAL4 系統篩選 cDNA 文庫或研究蛋白間的相互作用時,DNA 結合結構域與靶蛋白即誘餌”相結合,轉錄活化結構域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結合。一般情況下,單獨的 BD 可以與 GAL4 上游活化序列

GAL UAS結合但不能引起轉錄,單獨的 AD 則不能與 GAL UAS 結合,只有當 BD AD 分別表達的融合蛋白由于相互作用而導致兩者在空間上相互靠近時,BD  AD 才能與GAL UAS 結合并且引起報道基因的轉錄。在 BD  AD 要導入的酵母菌AH109 中,通過基因工程的方法在 GAL4 UASs 和啟動子的下游構建了 3 個報道基因——ADE2HIS3MEL1

 LacZ,因此可以通過營養缺陷篩選和酵母菌表型的改變來篩選或驗證兩個蛋白之間是否存在相互作用。

 
1. 系統特點

同以往研究蛋白質—蛋白質之間相互作用的實驗手段相比,雙雜交系統具有其獨特優勢。首先,融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內進行,蛋白質有可能保持天然的折疊狀態,類似其在體內生理狀態下的情況,這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的,因此較之后者,它所證實的蛋白質間相互作用將更接近于在體的真實水平。其次,雙雜交系統的敏感度即高,可以檢測到在蛋白質之間結合常數低至 1mmol/L 左右的微弱作用。許多微弱或短暫的蛋白質之間的相互作用可以借助報道基因表達過程中的多級放大效應反映出來;融合蛋白基因在強啟動子的作用下,處于較高的表達水平。第三,在篩選 cDNA 文庫時,雙雜交系統能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列,它只需構建質粒而不必準備抗體或純化蛋白,省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

需要指出的是,融合體蛋白必須轉運至核內才能活化轉錄,因此對于胞外配體—受體作用以及需要核外修飾或受磷酸化等翻譯后修飾過程介導的蛋白質間相互作用而言,該系統的應用受到一些限制。在進行文庫篩選時,假陽性結果常常干擾實驗的準確性,除某些文庫編碼的蛋白質本身含有轉錄活化成分外,細胞內的其它無關蛋白也可能有類似作用,因此雙雜交系統檢測的結果必須通過其它蛋白間相互作用的實驗來進一步驗證。
 

第二部分 實驗流程


一.培養基:

構建于 AD 載體的 cDNA 文庫的擴增


LB 液體培養基,121℃,15 lbf/ in2 滅菌 15min

A. bacto-Tryptone 10.0g

B. bacto-Yeast Extract 5.0g

C. NaCl 5.0g

D. 5N NaOH 調 pH ? 7.0

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E. ddH2O ? 1000.0 ml

* LB 固體培養平板為含有 1.8%瓊脂(Agar)的 LB 培養基

LB/Amp 培養基為含有 Amp 100 ug/ml(高壓后冷卻到 50℃加入)的 LB 培養基

 

 

二.實驗步驟:

 

1. -70℃冰箱取出含有 DNA 文庫的甘油菌,置于冰浴中緩慢化凍;

 

2. 用新鮮的 LB 培養液在 1.5ml 離心管中將上述甘油菌 1:106  1:108 稀釋;

 

3. 取稀釋菌液各 10ul 加入 90ul LB 培養液在 1.5ml 離心管中振蕩混勻,涂布 LB/Amp

 

平板(φ90mm); 37℃倒置培養過夜或 30℃培養 24-36hr,計數平板上單克隆菌落數;

 

4. 確定待擴增的 DNA 文庫滴度cfu/ml=克隆數108(1:106  稀釋)或克隆數1010(1:108稀釋)

5. 按照>2-4104cfu/平板的濃度,涂布 LB/Amp 平板(φ150mm),共 100 塊;37℃倒置培養過夜;

6. 在超凈臺上,將所有生長菌落的平板上加適量 LB 培養液,將菌落刮下,轉入 2000ml LB/ Amp 培養液中,37℃振蕩培養 2-4hr;

7. 留取適量培養菌液以 50%無菌甘油稀釋至 25%終濃度,分裝,保存于-70;

 

8. 其余培養菌液 8000rpm10min, 4℃,收集細菌;用質粒 DNA 純化試劑盒大量抽提質粒 DNA