CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9)是古細菌和細菌在與噬菌體抗爭的進化過程中逐漸形成的一種適應性免疫防御機制,可用來對抗外源入侵的DNA和病毒。CRISPR/Cas9系統將入侵質粒DNA和噬菌體的片段整合到CRISPR中,并利用相應的crRNA (CRISPR-derived RNAs)通過堿基互補配對方式與tracrRNA (trans-activating RNA)結合形成crRNA/tracrRNA復合物,該復合物能夠引導具有核酸酶活性的Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA,導致同源核苷酸序列的降解,進而提供免疫性。由于效率高、成本低等優勢,CRISPR/Cas9基因編輯技術是目前基因組研究中的寵兒,被稱為“基因魔剪”。

CRISPRCas9技術在基因治療領域的研究進展

圖1. CRISPR-Cas9系統

基因治療簡介

基因治療是指通過特殊的方法來改變患者的遺傳物質,將人的正常基因或者有治療作用的基因通過一定方式導入患者的靶細胞內,在體內或者體外直接針對患者的異常基因本身進行治療,從而達到治療疾病的目的。體內基因治療是指將治療基因直接注入患者體內,而體外治療需將靶細胞在體外修復擴增后再輸入患者體內,如CAR-T療法。相比于體內治療,體外治療的難度低、流程少,載體要求和安全性高,但實際應用有局限、且難以長期保持功效。

針對致病基因突變明確的遺傳疾病(如罕見病),基因治療特異靶向原有變異基因進行功能修復而達到治療目的,屬于典型的精準醫學范疇。由于CRISPR基因組編輯體系的載體構建容易、編輯效率高效、靶向位點選擇靈活,在基因治療開發方面具有很大的應用前景。

CRISPRCas9技術在基因治療領域的研究進展

圖2. CRISPR-Cas9基因治療的體內和體外策略

CRISPR-Cas9在基因治療遺傳性疾病方面的應用

目前, CRISPR/Cas9 技術已應用于鐮狀細胞性貧血、地中海貧血、杜氏肌營養不良、Crygc 基因突變引發的白內障、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、囊性纖維化、遺傳酪氨酸血癥Ⅰ型等遺傳性疾病的研究報道。在動物實驗中, 研究者們通過CRISPR/Cas9 技術編輯合子或早期胚胎中的基因組,構建基因修飾的新個體;或者改造生殖干細胞中的基因組,從而穩定遺傳至子代。

然而,上述策略如果應用于人類,必然會引發倫理爭議。CRISPR/Cas9 技術未來的臨床應用,更有可能是與人類誘導多能干細胞技術相結合,采用基于患者定制的個性化治療方案。目前,人類誘導多能干細胞的建系技術已相當成熟,制約其應用的主要因素在于定向誘導分化步驟。其中,像造血系細胞分化的研究相對更為深入,技術平臺相對穩定。

CRISPR-Cas9在癌癥方面的應用

2014 年,Torres等首次報道了應用CRISPR/Cas9技術構建癌癥模型的研究。在該研究中Cas9 在特異sgRNA 的引導下,在染色體特定位點切割,使被切割的染色體發生倒位和異位,準確模擬了人類一些腫瘤例如尤文氏肉瘤和急性髓系白血病的形成過程。同年,Xue等運用CRISPR/Cas9基因組編輯技術將抑癌基因p53 和pten 進行雙突變,成功地構建了肝癌動物模型。

Platt 等報道的肺腺癌小鼠腫瘤模型,是將器官靶向的各種亞型的AAV 載體作為CRISPR/Cas9 的遞送系統,成功實現在腦、肝、肺等器官中Cas9 核酶的特異性表達。由此可見,AAV 載體與CRISPR/Cas9技術的聯合運用將會在癌癥的個體化治療中發揮越來越重要的作用。

CRISPR-Cas9在治療病毒感染性疾病方面的應用

對于病毒感染性疾病,基因治療大致可分為兩種思路:改造病毒宿主細胞使其免于感染和靶向病毒使其不能完成復制和傳播。以HIV 病毒所致AIDS 的研究為例,HIV感染CD34+的淋巴細胞需要通過表面受體CCR5 或CXCR4 的介導。因此,可以將HIV 感染者的骨髓干細胞分離出來,通過CRISPR/Cas9 技術在體外將骨髓干細胞的CCR5 或CXCR4 受體基因失活,再將受體基因失活后的骨髓干細胞回輸給該患者,重建其免疫功能。慢性乙型肝炎由人類乙型肝炎病毒(HBV)感染導致,是肝硬化和肝癌的主要誘因之一。HBV 的共價閉合環狀DNA(cccDNA)對于病毒的持續性感染起了主要作用。因此, 清除被感染肝細胞內的HBV cccDNA 是臨床上徹底治愈慢性乙型肝炎的關鍵。多項研究表明,CRISPR/Cas9 技術可以特異性地靶向HBV cccDNA,從而有效抑制HBV 的復制。

存在的問題

CRISPR/Cas9基因組編輯技術用于臨床基因治療還需要解決的問題主要包括:

(1) 建立高效、特異和安全的導入方式:由于CRISPR體系分子量較大,體內原位導入存在比較大的挑戰,需要構建安全的導入載體,提升體內原位導入效率,增加細胞或組織特異性,以及增加對導入CRISPR材料的可控性 (如表達時間的控制)。

(2) 建立對脫靶效應的全面評估體系:基因組編輯可能導致的非預期基因的永久性突變會帶來嚴重的副作用,因此需要在提高CRISPR靶向特異性的同時,選擇或建立合適的脫靶檢測平臺或模型,提升脫靶率檢測的敏感性和全面性,對可能脫靶率及其可能導致的安全問題進行高通量和全方位評估。


參考文獻:

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